病原微生物检测在感染判定的意义
病原微生物是指可以侵犯人体，在宿主中生长繁殖、释放毒性物质等引起机体不同程度病理变化、发生感染的微生物，包括细菌、病毒、真菌、寄生虫、衣原体、支原体等。病原微生物检测并非新领域，基于病原学证据的抗感染一直都是临床诊疗的"金标准"。如果能尽早识别致病病原、启动恰当的抗感染方案可改善患者预后，尤其是重症感染者。病原微生物检测在感染判定中意义重大，越来越多的检测技术引入临床，除了传统的检测方法如涂片染色、培养分离、免疫学技术、核酸检测等，还有新兴的二代测序技术(NGS)等。虽然技术种类繁多、手段层出不穷，但对临床医生而言，如何正确选择、利用病原微生物检测方法、正确解读检测结果，才是临床诊治中的关键。所有对病原微生物检测结果的解读都应基于患者、基于临床。本文的侧重点并非概述各种病原微生物检测技术的原理及方法，而系如何利用不同的病原微生物检测技术协助感染判定。
1 不同的病原微生物检测技术在感染判定中的价值
临床医生应根据患者的病情、可能感染部位、可供采集的标本等选择适宜的检测技术。
1.1 涂片(染色)技术
当前，随着病原微生物检测技术的快速发展，传统的涂片技术似乎有被忽视的迹象。但涂片技术仍是细菌、真菌检查的最经典方法，其操作简单、快速，有一定的诊断敏感性和特异性。这种形态学检查对临床判定感染、快速获得病原学依据有不可替代性。不合格的标本无须再行培养，因为培养阳性可能误导临床。一般地，除了血液及粪便标本外，培养标本都应做涂片镜检(血培养阳性报警后必须涂片)；如镜检直接发现细菌或真菌菌丝、孢子，可考虑细菌、真菌感染。涂片结合染色分析更为准确，革兰染色检测普通细菌，抗酸染色检测抗酸杆菌，弱抗酸染色检查奴卡菌，10%KOH和(或)乳酸棉酚兰染色检查真菌，墨汁染色检查脑脊液中新型隐球菌，六胺银染色检查呼吸道标本中的肺孢子菌。
1.2 病原培养分离
培养分离虽耗时长、检出阳性率较低、获得病因证据相对困难，但仍是病原微生物检测的核心方法之一。其优势在于一方面培养分离出的是活微生物，非死菌，有助于确定致病病原菌。因核酸检测等分子生物学技术易受DNA气溶胶污染出现假阳性；菌体死亡后核酸仍可持续残留在机体内，此时行核酸检测亦能获得阳性结果。有研究显示，部分病原微生物感染后动态监测DNA携带时间可持续6个月以上。如果无法区分病原微生物是否具有活性，则常常会误导临床诊治。另一方面，培养能对阳性病原微生物进行菌种鉴定和药敏试验，提供药物敏感/耐药及最小抑菌浓度等信息，便于指导临床抗感染、避免无效治疗。此外，培养的菌落定量都是基于活菌计数，菌落形成单位(colony-forming units，CFU)可计算活的菌体数量。以呼吸道标本为例，通常认为痰培养细菌菌落计数>106 CFU/ml、支气管肺泡灌洗液菌落计数>104 CFU/ml、经支气管镜防污染毛刷菌落>103 CFU/ml时可考虑为感染；菌落计数≤103 CFU/ml为下呼吸道细菌定植阈值。由于临床中病毒、支原体等培养难度大，目前培养分离技术主要用于细菌、真菌和分枝杆菌。
微生物培养结果阳性不一定提示该微生物为致病微生物，阳性结果要综合患者其他临床数据分析是感染、定植还是污染菌群。如将污染、定植误诊为感染，可致抗生素滥用、耐药菌滋生和播散、住院时间延长、经济负担加重等；反之，对感染掉以轻心、误视为污染或定植，则可能致感染扩散、延误病情。无菌部位标本如血液、骨髓、脑脊液、胸腹腔积液、尿液等培养，排除污染因素后，任何阳性结果都可考虑感染。不同部位行多份血培养检测，如大多数或全部结果均为同一微生物生长，提示血流感染的可能性极高。单份血培养为金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肠杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌时也多提示血流感染。如血培养中出现草绿色链球菌(非感染性心内膜炎)、凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌时，则解释较复杂；研究表明上述病原菌导致真正血流感染的比例分别为38%、15%和78%，存在较高污染概率。虽然凝固酶阴性葡萄球菌是血培养中最常见污染菌之一，但对留置导尿管或体内置入仪器的患者而言，血培养凝固酶阴性葡萄球菌阳性需引起重视，不能直接考虑为污染菌。非无菌部位标本检测易受正常菌群影响，除外污染菌和定植菌后，检测到的微生物才能考虑为致病病原体。在分析有菌部位标本如粪便、呼吸道分泌物、各种留置导管中留取的体液时，需熟悉该部位常见的病原谱、定植谱及污染谱。如脑脊液是无菌部位体液且无定植菌，但经皮穿刺采集脑脊液时，皮肤定植菌如凝固酶阴性葡萄球菌、棒杆菌属可能污染脑脊液标本；有中枢引流管时导管流出的脑脊液可能会有定植菌污染。
1.3 组织病理诊断
包括组织培养在内的组织病理检测在感染判定时具有重要意义。如组织切片中发现真菌菌丝和孢子，需考虑存在深部真菌感染；曲霉菌感染常在病理组织中看到45°分支分隔的菌丝；发现粗大无分隔呈直角分支的菌丝应考虑毛霉菌感染；组织细胞内发现酵母细胞常提示组织胞浆菌或马尔尼菲篮状菌感染。组织病理中发现抗酸杆菌、肉芽肿以及干酪样坏死性病变时需高度警惕结核感染。
1.4 免疫学技术
免疫学技术包括抗原和抗体检测，如酶联免疫吸附试验、免疫荧光检测、免疫印迹法、免疫胶体金法等，可用于检测病毒、细菌及真菌。临床中常采用直接免疫荧光法进行抗原检测，其将标记有荧光素的已知抗体与细胞或组织中的相应抗原反应以发现病原微生物。抗原法是目前临床上呼吸道病毒检测的主流方法，但灵敏度较低、特异性抗体与不同抗原间可产生交叉反应出现假阳性等，故一定程度限制了其在感染诊断中的应用价值。血清IgM抗体通常早于IgG出现，提示近期感染，IgM抗体由阴转阳或双份血清抗体滴度4倍及4倍以上增高有诊断意义。机体感染后产生IgG抗体时间较晚，存在检测窗口期，在体内维持时间较长，故IgG阳性常被认为是既往感染。虽然IgM抗体早于IgG抗体出现，但免疫功能低下者可感染后不产生抗体出现假阴性。
1.5 聚合酶链式反应(PCR)
1.6 基于宏基因组二代测序技术(mNGS)
2 检测方法的选择与不容忽视的阴性结果
3 检测标本的管理
4 定植菌
5 结语
病原微生物检测技术快速发展，能识别的微生物种类越来越多，但感染首先是个临床诊断，所有的判定必须基于临床。更快、更准确地判定感染一直都是病原学检测的挑战，不同方法各有优劣。当前，并没有一项技术可通过从标本中识别微生物来直接判定机体是否感染该病原体，甚至依靠检测的阴性结果来排除感染都很难实现。检测技术革新带来的是临床辅助手段的进步和多样化，但病原微生物检测结果的解读和感染的判定不能脱离临床。在诊疗过程中，临床医生始终需要思考3个问题：患者是否存在感染；如果有感染，致病病原体是什么；如何治疗。从临床出发，充分利用现有的病原微生物检测方法和其他实验室检查手段，缜密分析，综合判定，可能对感染做出正确判定。引用: 武洁, 王荃. 病原微生物检测在感染判定的意义 [J] . 中国小儿急救医学,2020,27 (03): 175-180.CT见肺占位，PCT持续增高却不是感染，谜底在哪里？
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