单细胞+空间转录组|多组学探究人鳞状上皮癌肿瘤微环境
文章标题: Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma
期刊：cell（IF=41.58）
导读：单细胞测序技术和空间转录组测序技术的结合可以帮助我们更深入地了解有关肿瘤微环境内细胞间相互作用的信息。本文中，实验人员结合这两项技术及其它方法探究皮肤鳞状细胞癌(cSCC)的细胞组成和结构。通过将配体-受体网络映射到特定的细胞类型，他们发现肿瘤特异性角化细胞（TSK）是细胞间通讯的枢纽。他们还观察到多种潜在的免疫抑制特征，包括调节性T细胞(Treg)与CD8 T细胞在肿瘤间质中的共定位。最后，人类肿瘤异种移植的单细胞辨别和体内CRISPR检测确定了特定的肿瘤亚群富集基因网络在肿瘤发生中的重要作用。这些数据定义了cSCC肿瘤和基质细胞亚群，它们相互作用的空间位置，以及在癌症中它们参与的基因沟通网络。
实验设计
来自人类cSCC的48164个细胞被测序，空间转录组总计检测到17064个点。
技术平台
10X genomics
实验思路
⚫cSCC的多角度细胞图谱
实验人员对10位病人的cSCC及其对应的正常皮肤细胞进行scRNA-seq（图1A），通过聚类识别出肿瘤和正常上皮细胞以及基质细胞亚型（图1B）。除成纤维细胞，内皮细胞和生黑色素细胞外，基质细胞中还包含一系列免疫细胞（图1C，D）。细胞类型比例分析反映了样品处理的一致性（图1E，F）。
图1 正常皮肤细胞和cSCC的单细胞转录组图谱
⚫ TSK亚群
对正常上皮细胞进行重新聚类能够找到3个主要的角化细胞（KC）亚群（图2A）：基础，循环和分化。典型相关分析显示肿瘤KC广泛涵盖正常(基础、循环和分化)亚群，在正常皮肤细胞和cSCC中有几个共享的标记基因（图2A-2D）。肿瘤KC亚群与正常细胞有几种表达存在差异的基因（图2E）。因此，cSCC包含一般涵盖正常表皮细胞主要细胞状态的KC亚群，以及在正常皮肤中没有对应的肿瘤特异性TSK亚群。TSK特征基因与细胞运动和细胞外基质分解有关，提示侵袭性行为（图2E）。与此一致的是，TSK表达经典上皮-间充质转化(EMT)标记基因，如VIM和ITGA5（图2F）。此外，TSKs表现出最高的特征EMT基因标记的表达（图2G）。EMT样TSK细胞缺乏经典EMT转录因子（TF）的表达（图2H）。为此实验人员对其进行单细胞调控网络推理与聚类（SCENIC），结果发现AP1和ETS家族成员是潜在控制TSK的TF（图2I）。总的来看，cSCC表皮分化阶段在几个关键的方面失调：不能完全参与分化，基底细胞数量激增，出现一个表达EMT关联基因的亚群。
图2 肿瘤角质形成细胞分化等级失调
⚫ 空间转录组学在前沿识别基础TSK异质性
在所有患者中，肿瘤相关点表现出与肿瘤KC在scRNA-seq中相对应的基因表达，而免疫或基质基因与肿瘤邻近基质、无关基质或附属区域相关，与大体组织学cSCC结构一致（图3A）。用scRNA-seq的TSK标记基因为每个点打分可以在每位患者中找到一个突出的TSK-高度亚群，表达标志基因MMP10（图3B）。超过80%的TSK-高度亚群点都位于肿瘤的边缘，剩余的边缘点表现出基础肿瘤基因富集（图3E,3F）。
图3 空间转录组学揭示前沿异质性
⚫ cSCC的免疫图谱
为了解各类细胞如何参与cSCC的免疫活动，实验人员对细胞中已知的免疫抑制基因进行调查（图4A），从中可以看到许多与抑制T细胞细胞毒性相关的基因表达。这些基因的表达在空间转录组中表现出空间簇特异性模式，与特定细胞类型的共同定位一致，伴随髓系特异性因子在炎症前沿占主导地位（图4B,C）。耗竭CD4和CD8 T细胞亚群表达抑制受体和耗竭标志物以及细胞毒性基因（图4D）。从空间上看，T细胞转录出现在炎症前沿和免疫相关亚群中（图4E）。实验人员接下来通过分析scRNA-seq中的趋化因子和受体表达来评估肿瘤浸润淋巴细胞的潜在招募机制（图4F）。趋化因子受体的高度表达提示联合招募现象，与空间转录组中的定位一致（图4E）。这些结果突出了参与免疫抑制机制的多种细胞类型，包括对DC和耗竭性T细胞共抑制信号的诱导和Treg细胞的招募。
图4 cSCC的免疫图谱
⚫ 炎性TME的单细胞空间结构
为了在单细胞水平分析TME的空间结构，实验人员应用MIBI技术对18个视场（FOV）进行成像（图5A）。他们用细胞聚类方法对与scRNA-seq细胞类型相似的主要细胞类型进行了分类（图5B）。肿瘤内部和肿瘤之间的基质和免疫组成是不同的，12/17 的FOV在患者中并不一致（图5C）。在5/12 FOV中可以观察到Treg和CD8 T cell的共定位（图5F,G,H）。CD8 T细胞比例也与共定位呈正相关，提示Treg可能通过TME共招募和在CD8 T细胞位点处共定位来起调节作用。该模型与CD8 T细胞和Treg细胞之间共同接受募集趋化因子(图4F)以及CD8 T细胞对Treg介导免疫抑制的需求相一致。成纤维细胞、巨噬细胞和Treg细胞在肿瘤-间质边界最丰富，而CD8 T细胞和中性粒细胞在肿瘤外大部分被排除，提示Treg定位可能会阻止效应淋巴细胞进入肿瘤（图5J）。B细胞是唯一表现优先浸润的细胞类型（图5L）。因此在单细胞分辨率下对TME的空间分析能够突出可能代表治疗节点的定位，人工介入这些节点可以改善免疫控制。
图5 cSCC淋巴细胞亚群的空间结构
⚫ 在病变边缘区绘制细胞通讯图谱
接下来，实验人员整合scRNA-seq和空间转录组数据集来描述相邻肿瘤和边缘TME细胞之间的信号传导特征（图6A）。基于配体-受体对数据库中的数据进行分析，可以发现TSK广泛参与自分泌和旁分泌相互作用（图6B,C）。
图6 与病变边缘区相关的细胞通讯图谱
⚫ 异种移植肿瘤重现了人自发性cSCC细胞亚群
评估肿瘤亚群基因的功能需要一个具有代表性的人类cSCC模型。为了解决这一问题，实验人员从免疫受损小鼠的体内培养人SCC系肿瘤，并进行scRNA-seq（图7A）。对异种移植SCC细胞的特征评分和无偏聚类支持这些细胞是每个患者来源亚群的癌细胞再现（图7B,C）。对来自患者的细胞和异种移植细胞的类似TME细胞比较结果也揭示了人类和小鼠之间共享的标志基因高度重叠，异种移植中少数髓样细胞类型之间有细微的差异（图7D,7E）。通过一系列关联性验证可认为异种移植模型概括了cSCC 肿瘤内异质性（ITH）的关键特征。随后结合肿瘤角质细胞亚群基因的体内CRISPR检测，即可得到关于可能控制亚群体特异性前致瘤功能的关键基因信息（图7G）。
图7 肿瘤角质细胞脆弱性的体内CRISPR分析
参考文献：Ji AL, Rubin AJ, Thrane K, Jiang S, Reynolds DL, Meyers RM, Guo MG, George BM, Mollbrink A, Bergenstråhle J, Larsson L, Bai Y, Zhu B, Bhaduri A, Meyers JM, Rovira-Clavé X, Hollmig ST, Aasi SZ, Nolan GP, Lundeberg J, Khavari PA. Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma. Cell. 2020 Jul 23;182(2):497-514.e22. doi: 10.1016/j.cell.2020.05.039. Epub 2020 Jun 23. Erratum in: Cell. 2020 Sep 17;182(6):1661-1662. PMID: 32579974; PMCID: PMC7391009.
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