单细胞测序技术绘制肿瘤微环境的泛癌图谱
文章标题: A pan-cancer blueprint of the heterogeneous tumor microenvironment revealed by single-cell profiling
期刊: Cell Res（IF=25.617）
导读
肿瘤微环境由一组异质性的组织驻留细胞和肿瘤浸润细胞组成，这些细胞深受癌细胞的影响。为探究不同器官癌症之间的异质性，研究人员对来自肺癌、结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌患者(n = 36) 的样本进行分析，并使用不同的单细胞RNA测序和细胞表面蛋白检测技术构建基质细胞异质性的泛癌细胞图谱。最后，通过将该图谱应用于接受检查点免疫治疗的黑色素瘤患者，并识别幼稚CD4+ T细胞表型对检查点免疫治疗反应的预测能力，说明了如何将其作为解释scRNA-seq数据的指南。
科学问题
单细胞RNA测序技术的兴起，使我们可以对肿瘤微环境 (TME) 进行单细胞层面的分析，然而不同的癌症类型中是否存在相同的基质细胞表型仍然未知。
实验思路
主要结果
1. 肿瘤细胞和正常组织的单细胞测序
图1a中展示了被测序的样本，共50份肿瘤组织，17份正常组织，这些样本分别来自结直肠癌患者（CRC），肺癌患者（LC）和卵巢癌患者（OvC）。图1b展示了基于细胞类型对这些样本细胞的聚类，它可以帮助我们评估样本中肿瘤细胞与正常组织的组成比例，或是评估在每位患者的样本中肿瘤相对其它细胞类型的比例（图1c，d，e）。其中，T细胞是肿瘤组织中最常见的细胞类型。
图1 实验设计和细胞分类
2. 各细胞类型的亚型图谱
接下来分别对内皮细胞、成纤维细胞、树突状细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等根据其特异表达的基因做进一步单独聚类，并比较各个细胞亚型在3种癌症样本间及在肿瘤组织和正常组织的占比。使用PCA-unaligned和CCA-aligned方法对8223个内皮细胞(ECs)的转录组进行聚类，分别鉴定出13个和9个簇，CCA结果中，有5个亚群在不同癌症组织中共有，分别为C1_ESM1（顶细胞）、C2_ACKR1（高内皮细胞微静脉和静脉内皮细胞）、C3-CA4（毛细血管）、C4_FBLN5、C5_PROX1，其中顶细胞主要存在于CRC中，而高内皮细胞微静脉和静脉内皮细胞主要存在于多种癌组织中，毛细血管内皮细胞多集中于正常组织。同时，PCA-Unaligned将C3-CA4分为了5个更小的亚群，NEC1–NEC4来源于正常组织（2g），表明内皮细胞的组织特异性仅限于正常组织。而成纤维细胞是多种组织共有的一种细胞类型，显示出最高的癌症类型特异性；结肠特异性亚群主要存在于正常组织中，树突状细胞和T细胞的组织特异性较低，而B细胞中，除了主要存在于富含粘膜的正常结肠中的浆细胞，其他所有肿瘤中都富含B细胞。髓系细胞中，除了常驻肺泡巨噬细胞（C8），其他髓细胞亚群存在于所有癌症类型中。
图2内皮细胞的聚类图谱
3. 乳腺癌细胞的图谱绘制
在3种癌症样本中，共鉴定到68种基质细胞亚型，其中46种为所有癌症样本所共有。为了证实这种共性，实验人员使用5 ' -scRNA-seq对14例未治疗乳腺癌(BC)进行分析并重新聚类结果显示每个细胞表型都具有与 3'-scRNA-seq 相似的表达特征。有趣的是，在不同癌症类型间，每种细胞的标记基因和潜在TFs高度相似，表明基质细胞图谱也适用于其他癌症类型。
图3 基质细胞图谱检验
4. 在蛋白水平验证图谱的有效性
借助CITE-seq技术，研究者在蛋白水平上进一步验证了癌症图谱。实验共获得6194个乳腺癌细胞的转录组和蛋白质组数据。术后将这些细胞与上述实验中生成的细胞数据合并在一起后基于scRNA-seq数据进行聚类，结果显示每个T/ NK细胞被准确地分配到其表型对应的亚群中。随后，从198个抗体中选择标记基因，探索每个亚群的蛋白表达。结果显示CD3、CD4、CD8和NCR1组合可以有效地识别CD4+、CD8+ T细胞和NK细胞。T细胞耗竭标志物PD-1能区分耗竭性CD4+和CD8+ T细胞(C1, C7)， 而IL2RA (CD25)是CD4+ Tregs (C8) 的标志物。CD8+ 记忆T细胞(C3)的特征是ITGA1高而PDCD1低。细胞毒性T/NK细胞(C4, C9)均有较高水平的KLRG1等。以上结果证实，与scRNA-seq数据相比，基于CITE-seq开发的随机森林预测模型将大于80%的细胞归为同一细胞(子)类型，进一步证实scRNA-seq数据结果的准确性。
参考文献
[1]. Qian J, Olbrecht S, Boeckx B, Vos H, Laoui D, Etlioglu E, Wauters E, Pomella V, Verbandt S, Busschaert P, Bassez A, Franken A, Bempt MV, Xiong J, Weynand B, van Herck Y, Antoranz A, Bosisio FM, Thienpont B, Floris G, Vergote I, Smeets A, Tejpar S, Lambrechts D. A pan-cancer blueprint of the heterogeneous tumor microenvironment revealed by single-cell profiling. Cell Res. 2020 Sep;30(9):745-762. doi: 10.1038/s41422-020-0355-0. Epub 2020 Jun 19. PMID: 32561858; PMCID: PMC7608385.
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