lncRNA鉴定专题-样本和测序要求
lncRNA测序采用 Illumina HiSeq 平台进行测序，针对有参考基因组样本开展准确的 lncRNA 鉴定和 lncRNA 靶基因预测，同时提供针对测序数据中 mRNA 的分析，结果更全面，广泛应用于医学、农学研究领域。
技术路线
样本要求
lncRNA鉴定
1.文件准备
下载参考基因组及gtf文件，或者自己组装的也可以使用
准备cDNA或mRNA序列，如有lncRNA序列也可直接使用
2.比对基因组
软件：RWA，Tophat,Hisat2
每个样本的测序数据mapping到基因组
3.转录本组装
这里可以选择cufflink或者Stringtie，重点推荐Stringtie。Stringtie能够拼接处更完整、更准确的基因，并且Stringtie采用拼接和定量同步运行，相对于其他方法，其定量结果更准确
根据评测，对于从人类血液中获得的reads，Stringtie正确组装了10,990个转录本，而Cufflinks只组装了7,187个。对于模拟的数据集，Stringtie正确组装了7,559个转录本，比Cufflinks的6,310个提高了20%。此外，它的运行速度也比其他组装软件更快
4.转录本合并
方法：可使用cuffmerge，Stringtie merge,TACO三个软件合并所有gtf文件。而当样本数目急剧增加时，合并得到的转录本数目会增加，假阳性率也会随之升高。这里推荐NATmethods最新发表的软件TACO来进行大样本gtf文件的整合
说明：当样本较少的时候，三种软件整合出的基因亚型相差不大。如果样本数目大于50时，cuffmerge和Stringtie在固定的区域 会整合出长的假的嵌合体和较多的亚型，而TACO结果则保持一致的基因亚型
5.lncRNA过滤
a.可选步骤
根据blast结果过滤与已知lncRNA大于0.9相似的转录本
Nr,Pfam,Dfam,animal/plant nc database都可以进行blast比对来进一步过滤
ORF长度预测，一般过滤大于50AA的转录本
b.软件特有步骤
Cufflink结果中可选择class-code为“i，j，u，o”的转录本作为保留
Stringtie和TACO结果根据位置关系过滤掉与已知转录本位置和方向重合的转录本，保留反义转录本
c.必备步骤
过滤exon小于2，长度小于200bp，FPKM小于1的转录本
分别用CPC，CNCI，PfamScan三个软件来对进行编码潜能预测，保留非编码转录本
d.三大主流网站
PfamScan：http://pfam.xfam.org/
CPC：http://cpc.cbi.pku.edu.cn/
CNC：https://github.com/www-bioinfo-org/CNCI
鉴定标准：
CPC_threshold = 0，大于0的转录本为mRNA，小于0的为lncRNA；
CNCI_threshold = 0，大于0的转录本为mRNA，小于0的为lncRNA；
PfamScan：比对上Pfam蛋白数据库的为mRNA，没有比对上的为lncRNA；
注意：cpc和PfamScan需要先建立蛋白参考数据库，cpc可以下载Uniprot/swissprot蛋白序列；PfamScan输入的是蛋白序列，可以由cpc的预测结果得出。
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参考资料
基因帮：lncRNA研究思路与方法
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