降维后进行可视化
大神一句话，菜鸟跑半年。我不是大神，但我可以缩短你走弯路的半年~
就像歌儿唱的那样，如果你不知道该往哪儿走，就留在这学点生信好不好~
这里有豆豆和花花的学习历程，从新手到进阶，生信路上有你有我！
豆豆发送于19.9.27
来自Bioconductor放出的单细胞数据分析教程
https://bioconductor.org/packages/release/workflows/vignettes/simpleSingleCell/inst/doc/reads.html
1 利用PCA
对前三个主成分进行两两比较，看看细胞之间的联系
具有相似表达谱的细胞距离会更近（可以理解成每个细胞中都是一万多基因表达，这些基因有的表达高有的表达少，这种高低交错的形态就是表达谱。如果两个细胞都有相似的这种高低交错形态，那么它们可能就具有相似的基因表达特性，于是更有可能是同一类细胞。PCA就是衡量每个细胞中这一万多个基因的表达特性，来对这些细胞进行”种群划分“）
首先根据细胞生物学分类（control和treat）画PCA
plotReducedDim(sce, use_dimred="PCA", ncomponents=3,
colour_by="Oncogene") + fontsize
图中可以看到，PC1+PC2的效果是最好的（左侧中部图）
然后根据plate信息画PCA
目的是看看之前的去除批次做的效果如何，如果结果还是和上图一样能分开，那么就表示plate差异依然很大，足够撼动真实的生物学差异
plotReducedDim(sce, use_dimred="PCA", ncomponents=3,
colour_by="Plate") + fontsize
还是看最具代表性的PC1+PC2：不同plate的细胞分不开，说明之前removeBatchEffect()是成功的
注意：
plotReducedDim()会使用之前利用denoisePCA()得到的结果，而且可以一次画多个主成分两两比较，视觉效果更直观。
作者建议
每个作图函数，都能根据细胞类型去调整点的颜色和大小，一般会设置：
size_by=和shape_by=虽然还有许多主成分，但它们包含的信息量远不如前几个主成分
2 利用tSNE
另一个常用的降维算法就是t-stochastic neighbour embedding (t-SNE)，是基于在邻域图上随机游走的概率分布。它比PCA的强大之处在于，如果细胞群体很多，tSNE依然可以很好地将细胞按一定规则区分。这是因为tSNE能在高维空间中直接捕获细胞非线性关系，而PCA必须在线性的坐标轴上去展示它们。不过tSNE的计算量会更大，而且参数设置更复杂，一方面针对tSNE每次映射的坐标都不同，要设置随机种子，方便别人重复；另一方面需要设置perplexity参数，它会影响最后显示的细胞分类情况，perplexity的含义是：the number of close neighbors each point has
下面会利用PCA降维结果继续使用多个perplexity值进行tSNE可视化
set.seed(100)
out5 <- plotTSNE(sce, run_args=list(use_dimred="PCA", perplexity=5),
colour_by="Oncogene") + fontsize + ggtitle("Perplexity = 5")
set.seed(100)
out10 <- plotTSNE(sce, run_args=list(use_dimred="PCA", perplexity=10),
colour_by="Oncogene") + fontsize + ggtitle("Perplexity = 10")
set.seed(100)
out20 <- plotTSNE(sce, run_args=list(use_dimred="PCA", perplexity=20),
colour_by="Oncogene") + fontsize + ggtitle("Perplexity = 20")
multiplot(out5, out10, out20, cols=3)
因为tSNE是一个随机的算法，所以我们要多试验几遍，确保结果具有代表性（相当于多做几次实验重复，增加可靠性）；最终的脚本要使用set.seed()保证可重复性；不同的perplexity 会影响细胞在低维空间的分布
从上面图中，如果认为perplexity=20效果还不错，因此下面继续跑runTSNE时就可以设置perplexity=20
set.seed(100)
sce <- runTSNE(sce, use_dimred="PCA", perplexity=20)
reducedDimNames(sce)
## [1] "PCA" "TSNE"
除此以外，还有许多降维的方法：例如multidimensional scaling、 diffusion maps，当然不同算法各有自己的适用范围，比如 diffusion maps（plotDiffusionMap） 会将细胞放在一个连续的轨迹上，这在推断分化过程方面是很有效的
作者建议
如何解释tSNE图？可以参考https://distill.pub/2016/misread-tsne/ 其中映射到二维坐标上的cluster之间的距离其实没什么意义，还有cluster的大小（也就是其中点的分布稀疏程度，而不是指其中包含点的多少。对于同等数量的点，分布分散一点形成的cluster就大）也是没什么具体意义。它只是一种二维空间再现高维空间的手段
perplexity的值一般设为5-50，可以看一下上面链接中给出的测试图：当这个值不在5-50范围时，点聚成的形状就很奇怪图4 另外画tsne图时一般要重复很多次，因为重复次数越多，画出的图形状越稳定，上图中使用了5000次重复，下图如果仅仅使用120次重复，结果会是：
图5 tsne图中的点距离并没有意义，用两张图就能说明：
第一张：本来绿色的点和其他两种是有距离的，但是当设置的perplexity增大发现，图中它们距离是差不多相等的。Wait！那如果设成50不就可以了吗？图6 从这个图中看好像是的，但是…
如果增加原本点的个数，依然是绿色与其他两种有原始距离，使用perplexity=50，结果依然得不出相似的结论，说明perplexity不是一个固定的值，它会根据分析点的数量而变化，得到的结果也不能反应原始数据结构
图7 tSNE能做的，只是将原本聚在一起的，现在依旧聚在一起，并且有时会给你一些数据形状
图8 tSNE使用很流行的一个原因就是：它很灵活，经常能帮助寻找到数据的结构（像线性方法PCA就不可以），不过想要找点的距离远近就不要看tSNE了
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