正确的分析工具箱是推动基因治疗管线向前发展的关键
本文节选自《The right analytical toolbox is key to moving your pipeline forward》，详细内容，请参考原文。
病毒基因治疗领域内载体分析技术的进展已经超出了简单的病毒基因组qPCR检测定量。应用完善的分析方法，来表征载体质量，对提高载体一致性至关重要，这对于比较使用多个rAAV生产批次进行研究的生物学结果是必要的。随着越来越多AAV基因产品进入早期和晚期临床试验阶段，拥有正确的工艺，来确保一致性、质量和效力，比以往任何时候都更加重要 - 正确的分析技术可以指导你做出正确的决定。本文将介绍用于工艺内优化的最先进的分析测试技术，并探索使用它们的最佳时间。除了拥有特定的技术之外，探索其它科学领域不同的途径也是将病毒载体测试分析表征推向新前沿的另一种方法。
选择合适的工具
目前生物技术中最热门的项目是使用病毒载体来递送治疗方式。如果你在美国马萨诸塞州剑桥市的Kendall 广场走三个街区，就会发现很难找到一家初创公司没有使用这些漂亮的小颗粒作为递送工具。其中一种常用的特殊病毒载体是腺相关病毒(AAV)。AAV可以有几种“变体”：可靠的AAV2血清型已经被证明可以治疗遗传性失明，或者“万能”的AAV9，目前正在治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)患者。这样的例子不胜枚举；你会看到AAV5、6、7、7m8、Anc80、2tyf、DJ……这些不同的血清型带来了广泛而独特的生物分布特性，这有助于解释为什么AAV目前被视为基因递送的支柱。不幸的是，由于有如此多的变异、突变、氨基酸交换等等，那些参与AAV制造的人不得不想出独特的方法来生产并纯化这些病毒载体。这些科学家正在研究使用50L生物反应器，或将大量的样品泵入层析系统，他们需要尽可能好的分析方法来确认他们的优化工作是成功的还是失败的。拥有正确的分析策略是确保采取正确决策以及获得值得信赖的答案的关键。
像任何优秀的木匠或建筑工人一样，分析团队需要使用正确的工具箱来完成工作。表1是正确的工具箱的示例 - 有了这些可用的分析方法，您就可以生成所需的答案，以便将您的管线向前推进。
但是，有一个重要的警告：要得到您需要的答案，您就需要知道要问的正确问题，也就是要使用最佳的测试方法。
用于上游开发的分析工具
上游工程师是所有工作的开始；他们是创造最终治疗性产物的第一步。通过配备50L反应器或0.5L摇瓶，他们正在突破他们能力的极限，以充分利用细胞来生产关键的基因传递系统。在这种情况下，使用的最佳工具之一将是经过试验且真实的基因组定量分析：液滴数字PCR (ddPCR)。这是一种检测基因组滴度的方法，也是我们现在放弃标准qPCR的原因。与旧的方法相比，ddPCR具有明显的优点：它提供了一个绝对值，更加准确，并且不太容易受到常见抑制剂对基因组定量输出结果的影响。然而，作为一个分析科学家，只使用一种工具是不够的！如果ddPCR的滴度结果不是预期的，下一步的工作将是找出问题出在哪里。要完全了解什么进入细胞，什么从细胞出来，分析科学家将需要进行两种以上的分析；Western blot和总载体颗粒。这两种检测将有助于解释为什么基因组滴度可能偏低。
Western blot将显示三种AAV结构蛋白：VP1、VP2和VP3，其在细胞内表达(做一个时间点分析会更好)。我们已经知道AAV中的三种VP蛋白在细胞内都有不同的功能。Le等认为，VP1驱动病毒的感染性，VP2是形成颗粒的关键，VP3驱动基因组的包封。看到这些蛋白质的表达将会增加对滴度含义的充分理解。与Western blot方法一样，衣壳ELISA方法广泛应用于AAV颗粒的测定。这些检测结合在一起将提供一些关键的信息，可以影响上游工艺开发的优化。
用于下游/制剂开发的分析工具
下游纯化专家优先考虑的是避免污染和去除杂质；所有这些都是为了保持最高的质量和产量。他们还需要确保用于病毒载体的合适的制剂配方，并使其适合注射。当在这些步骤中需要进行优化时，所需要的分析方法必须准确、可靠且高通量。同样，最重要的是通过ddPCR对病毒进行定量。然而，尽管这种方法可以告诉您有多少病毒，但对于下游优化，你需要了解更多的信息。
除了ddPCR，还需要对纯度、效力和安全性进行评估，以了解优化后的方案是否有效。对于任何优化后的下游操作，待测样品的数量都将是巨大的，有合适的分析方法来快速对其进行分析将至关重要。采用多重PCR法检测残留物，如宿主细胞DNA/辅助质粒和病毒，是一种选择，这种方法将允许分析人员检测AAV滴度，然后计算工艺残留物的含量。在测试大量样品时，另一个可以考虑的方法是对常见的工艺中残留物，如核酸酶（Benzonase）、去污剂和层析柱析出物进行高效液相色谱检测，因为这种方法可以实现自动化以及结果的快速周转。同样重要的是，要有可靠的效力分析，以确保所做的一切不会改变任何衣壳结构，而阻碍病毒的“工作”能力。
最后，制剂不会离纯化链太远。为了避免在溶液中形成聚体，这里所要求的测试方法首先将评估是否有正确的制剂浓度。当然，应该进行经过试验的、且真实的ddPCR；但与此实验一起，进行DLS (动态光散射)检测也是至关重要的，它将给你溶液中颗粒的信息，因为有正确的制剂来避免聚集非常关键。此外，纯化策略的优化将导致残留杂质的不断去除，从而使载体的制剂成为一项持续的工作。
总结
基因治疗领域正以指数速度增长，随着时间的推移，它将成为一个极为突出的医学领域。拥有合适的生产工艺可以成就任何致力于利用病毒载体作为递送工具的生物技术公司。要有正确的工艺，关键是要有正确的分析测试方法，以确定什么是“好的”，什么是“坏的”。幸运的是，有很多可用的工具可以用来回答这些问题，但是必须明智地使用它们来获得所需的信息，而不生成不必要的数据。因此，对于分析人员来说，制定一个计划，以充分利用他的分析工具箱是非常必要的。表2提供了评估工艺开发中关键变更的正确方法的概要。通过在正确的时间进行正确的分析，分析人员可以提供描绘工艺开发有用图景所需的关键信息，从而实现工艺优化，并最终推动产品管线发展。
原文：A.Espejo, The right analytical toolbox is key to moving your pipeline forward. Cell & Gene Therapy Insights 2020; 6(7), 1029–1033, DOI: 10.18609/cgti.2020.113
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