下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识
下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识
摘要
近年来，宏基因组二代测序（mNGS）技术在下呼吸道感染（LRTI）病原诊断领域得到了广泛应用，国内临床医师在mNGS的临床应用方面已积累了一定的经验和证据。但mNGS在LRTI病原诊断中的适用场景仍缺乏规范，mNGS报告的临床意义解读也缺乏专业的指导意见。
本共识基于mNGS在我国LRTI病原诊断方面的应用实践，梳理mNGS在LRTI应用领域的瓶颈问题，汇总本领域专家意见，明确了mNGS在LRTI病原诊断中的适用场景，为mNGS报告临床意义提供了一条合理可行的解读路径，以期规范mNGS在LRTI中科学合理应用。
本共识采用问答的形式，首先提出需要阐明的问题，经共识写作组讨论后确定入选问题，在梳理临床证据的基础上给出每个问题的推荐意见及理由，并附上典型应用案例及其解析，方便读者掌握共识要点。
本共识适用于青少年和成人LRTI。一、LRTI病原学诊断方法学
问题1：mNGS 和传统微生物检测方法相比的优势与不足是什么？
传统微生物检测方法技术成熟，可靠性较高，临床应用实践多；mNGS技术理论上能非预设性、一次性检测未知病原，检测范围更广，但存在技术复杂、报告解读困难等不足。与传统微生物学检测方法相比，mNGS的优缺点见表1。不同的病原学诊断方法都有其各自的适用场景与前提，需要根据患者群体、病情特点、可疑病原微生物类别、当地实验室条件，选择适宜检测方法。
二、患者的选择
问题2：哪些疑似LRTI 的临床场景需考虑通过送检mNGS 明确病原微生物？
1. 免疫抑制宿主疑似发生LRTI且临床表现提示非CAP常见病原微生物所致者。免疫抑制宿主包括原发性免疫抑制宿主、进展期恶性肿瘤患者或感染前1年内罹患恶性肿瘤患者（不含Ⅰ期肺癌等早期恶性肿瘤或局限性皮肤癌）、正在接受化疗的恶性肿瘤患者、HIV感染伴CD4+T淋巴细胞计数<200/μl、实体器官移植受者、造血干细胞移植患者、长期使用较大剂量糖皮质激素治疗患者（等效泼尼松≥20 mg/d且持续≥14 d，或等效泼尼松累积剂量>700 mg）、接受生物免疫调节剂治疗患者［如抗肿瘤坏死因子（TNF）⁃α单克隆抗体等］、接受缓解病情抗风湿药或其他免疫抑制药物（如环孢素、环磷酰胺、甲氨蝶呤等）治疗的患者、各种原因导致的粒细胞缺乏患者（外周血中性粒细胞计数<0.5×109/L）等。
2. LRTI患者发病初期即出现需要使用血管活性药物的感染性休克、需要有创机械通气的呼吸衰竭、多脏器功能不全等危及生命的状况时；LRTI经规范经验性抗感染治疗48~72 h后，感染症状仍持续加重或影像学快速进展者。
3. 聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的LRTI；有特殊病史（如近期境外或野外旅游史）且经验性治疗无效，病情较为严重的LRTI；临床考虑特殊病原体（如钩端螺旋体、嗜肺军团菌、鹦鹉热衣原体等）感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时。
4. 患者有LRTI症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致（如结缔组织疾病的肺部累及、肺淋巴瘤等），可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS以帮助鉴别诊断。
问题3：哪些临床场景通常不建议送检mNGS？
1. 免疫功能健全宿主罹患LRTI（包括重症肺炎），经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转。
2. LRTI已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效。
3. 无法获取优质标本。
问题4：如何根据所在医院微生物检测能力差异化送检mNGS 诊断LRTI？
mNGS技术本身具有价格昂贵、技术复杂、结果解读难度大的特点，不建议mNGS替代传统生物检测。在传统微生物检测能力不足的医疗单位，对于疑难、复杂或危重感染病例，可以考虑将mNGS作为传统的补充手段。原则上应首先针对可疑病原微生物选择可靠的检测方法，包括PCR等特异性的分子检测，但在缺乏相应检测手段的情况下，可将mNGS作为备选。例如，疑诊病毒性肺炎或非典型病原体肺炎患者，应首选针对常见呼吸道病毒和非典型病原体的PCR 或多重PCR 和（或）抗原检测，在常规检测阴性或本机构无法进行相关检测时，可将mNGS作为重症患者的选择。
三、标本选择、采集和运送规范及质量评估
问题5：如何根据LRTI 特点选择mNGS 送检标本类型？
在LRTI的病原微生物诊断中，可用于mNGS检测的标本包括痰（含诱导痰）、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（BALF）、经支气管肺活检（TBLB） 标本、经支气管内超声（EBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等。
（5）标本采集所需要的医疗费用。
表2比较了常用呼吸道标本的临床适用场景。
四、mNGS的关键实验室技术参数
五、mNGS报告解读
问题11：如何根据mNGS 阴性报告作出临床决策？
问题12：mNGS 报告中出现多种病原微生物如何解读？
mNGS检测中出现多种病原微生物时，推荐首先通过显微镜检查、培养、抗原、PCR等方法确认，并结合临床特征解读。必要时可通过不同部位标本mNGS检测结果进行相互印证。
mNGS可在一份标本中检测到多种微生物，当出现以下情况时，考虑其中一种或多种微生物为假阳性结果：
（1）标本质量不合格；
（2）标本采集、送检过程受呼吸道定植菌、皮肤定植菌、环境菌、工程菌的污染；（3）检测过程中背景菌的质量控制不严格；
（4）患者的职业和生活环境、基础疾病、临床特点和影像特征与检出的微生物不相符；
（5）无法用其他微生物学方法验证；
（6）治疗反应和疾病转归与检出的微生物不相符。
以下临床场景多支持mNGS检出的多病原微生物为真阳性结果：
（1）误吸风险或明确误吸史的患者，出现多种常见口腔定植菌，需考虑吸入性肺炎/肺脓肿。此类病例常可同时在下呼吸道标本涂片和（或）培养中检出相应的混杂菌群。
（2）CAP患者有时会出现细菌、非典型病原体、呼吸道病毒等混合感染。
（3）免疫缺陷宿主LRTI常发生细菌、真菌、病毒、分枝杆菌等病原微生物的混合感染。
问题13：标本类型对解读mNGS 报告有什么影响？
1. 痰（包括诱导痰）、气管吸引物、BALF及各种经支气管肺活检标本：
（1）易受口腔或上呼吸道常见定植微生物的污染，主要包括念珠菌属、链球菌属、葡萄球菌属、奈瑟菌属、厌氧菌等。
（2）BALF标本中致病微生物的载量通常较高，受非致病微生物和人源核酸的干扰较小，当疑似感染部位BALF标本的mNGS检测结果为阴性时，虽然不能据此完全排除感染，但可作为排除感染的重要依据，应结合临床表现、肺部影像表现、抗感染治疗反应及其他病原微生物检测结果重新审视感染的诊断是否正确。
（3）经支气管肺活检标本通常组织块较小，有时可能来自于感染周边的反应性炎症区域，致病微生物的载量可能较低，同时人源核酸占比高，检测结果受的干扰较大，所以其阴性结果并不能排除感染。
2. 胸腔积液与肺组织标本：
（1）经皮穿刺标本易受皮肤定植微生物或环境微生物污染，如表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、耻垢杆菌、丙酸杆菌等。
（2）经皮肺穿刺活检标本通常组织块较小，有时可能来自于感染周边的反应性炎症区域，致病微生物的载量可能较低，同时人源核酸占比高，检测结果受的干扰较大，因此其阴性结果不能排除感染，但如果mNGS的送检标本为大块的外科手术活检或切除标本，其阴性结果应该可以作为排除感染的重要依据；
（3）脓胸中虽然致病微生物的载量较高，但也同时存在大量的炎症细胞，人源核酸占比高，mNGS检测过程中的去人源核酸操作可能导致检测结果呈假阴性。
3. 血液：
（1）正常人的血液中可能存在皮肤、肠道或上呼吸道定植微生物死亡后崩解产生的微量核酸片段，血液检出致病微生物序列不代表该病原微生物来自呼吸道，也可能来自肠道或者其他部位。
（2）血液标本检出CMV、EB 病毒等DNA 病毒时，只能说明血液中存在病毒核酸，是否存在病毒性肺炎需要结合临床表现、肺部影像表现和下呼吸道标本的检测结果综合判断。
（3）血液标本中致病微生物的载量往往较低，而且检测结果受人源核酸的干扰较大，其阴性结果不能排除感染。
（4）血浆微生物mNGS 与其他体液mNGS 不同，是无细胞的游离DNA（cell⁃free DNA，cfDNA）测序，在去除血细胞的过程中可能导致胞内病原体（如立克次体、衣原体等）被同时去除，因而某些胞内致病微生物感染可能出现假阴性，可考虑对血细胞层进行mNGS检测。
问题14：mNGS 报告中低reads 数微生物如何解读？
1 . mNGS报告一些病原微生物的reads数低时，应从以下几个方面加以考虑：
（1）某些病原微生物的核酸提取效率低和（或）标本中该病原载量较低；
（2）采样、运输和实验过程中引入污染可能，结合临床分析之后，若考虑此低reads微生物不是致病微生物，应考虑污染或者假阳性结果；
（3）生信分析中出现假阳性结果。
2. 临床医生应结合患者临床表现、影像学、常规微生物学检测结果，综合判断该低reads病原微生物的临床价值。如果怀疑此微生物感染，条件允许时采用另一方法验证。检测出低reads病原微生物无法用临床微生物常规方法进行验证时，可要求检测方提供该微生物原始数据，直接与高质量的参考基因组比对，如果此病原微生物意义重大，条件允许，也可以自行设计PCR 引物或一代测序等验证。
（1）某些微生物核酸提取效率较低，致其检出reads数少，例如，BALF mNGS测出少量结核分枝杆菌的reads，应关注Xpert MTB/RIF是否阳性；BALFmNGS测出少量新型隐球菌的reads，应关注外周血或BALF 隐球菌荚膜多糖抗原检测结果；BALFmNGS 测出少量曲霉菌的reads，应关注BALF GM和（或）曲霉菌属IgG抗体结果；
（2）血浆cfDNA 测序对于胞内病原体（如立克次体、衣原体等）测得的reads往往较低；
（3）如果血或呼吸道标本mNGS报告低reads 数的病毒，应关注PCR 检测结果；
（4）BALF报告某些易培养的细菌低reads数，应关注BALF细菌培养的结果；
（5）血浆mNGS报告一些低reads数微生物时，有可能是其他部位的感染，微生物被抗菌药物、人的免疫细胞裂解后释放出游离核酸，循环入血后被核酸外切酶裂解成小片段的cfDNA，也可能是其他部位定植的微生物，例如造血干细胞移植患者往往肠道屏障受损，可从血浆mNGS中检测出低reads数的部分肠道微生物。
3. 对于难以确定临床意义的低序列数微生物，必要时可进行MDT讨论。
问题15：根据mNGS 报告结果，何种情况下应该考虑追踪mNGS 检测的原始数据列表？
mNGS检测结果报告还存在一定的漏报比例，尤其是胞内感染或破壁困难的病原微生物、临床少见的病原微生物。检测报告发现的这些病原微生物信号偏低，且和阴性对照检出的序列数相当时，实验室可能会考虑不报告。因此，如果临床上根据患者的病史、影像学和常规实验室检查仍然高度怀疑感染性疾病，质疑mNGS 报告给出的检测结果时，可以考虑向检测实验室追踪检测结果的原始数据列表，结合临床资料在其中查找可能的病原微生物。
问题16：LRTI 病原诊断中耐药基因、毒力基因意义如何？
mNGS可提供耐药基因与毒力基因，但受限于序列读长和测序深度，尚有一定局限性：
（1）对于如水解酶等耐药机制，难以获得基因全长序列，不能深入分析耐药基因亚型。
（2）基因点突变是病毒（如CMV、流感病毒等）和结核分枝杆菌等常见的耐药机制，需要足够的测序深度和精准度，才能检出相关基因突变，预测耐药信息。
（3）mNGS结果易受标本类型及质量等因素影响。检出多种微生物时，耐药与毒力基因难以精准匹配到具体微生物。
（4）难以确定耐药或毒力基因型与其表型的一致性，即mNGS检测获得的基因信息只能定性地提示致病微生物可能具有某一种耐药机制，但无法确定该耐药基因是否表达，也无法得出药敏表型。
（5）耐药基因与毒力基因仅占病原微生物全基因组的一小部分，检测敏感度有限，假阴性率高。因此，应谨慎解读mNGS中耐药基因和毒力基因的检测结果。
六、多学科会诊（MDT）
问题17：如何结合mNGS 报告组织疑难LRTI MDT？
1. 针对疑难LRTI病例的会诊，建议由医务部门或相关科室，组织呼吸与危重症、感染、临床微生物、临床药学等专业人员共同参与。必要时可以扩大会诊参与范围，如特殊部位考虑对应专科，特殊年龄考虑儿科、老年病、感染控制等专科，特殊情况考虑病理、影像等，必要时邀请熟悉mNGS试验流程的生信和技术人员参加。会诊应立足临床信息，并围绕mNGS报告及其他微生物检验结果进行解释，对相应感染进行判断，对进一步处置和感染控制给出建议。
2. 如mNGS报告检出具有公共卫生安全隐患或国家法定传染病的病原微生物时，应严格按照国家传染病法规和院内传染病防控管理要求，对患者及接触患者的会诊人员、患者标本综合处置，严格执行隔离与上报制度。
七、展望
与常规下呼吸道病原微生物检测方法相比，mNGS的规范应用可高效、准确、全面地识别病原微生物，有助于感染性疾病的早期诊断，也可以对病原微生物进行快速流行病学分析，确定潜在的传播链。但是，mNGS技术上存在局限性，如假阳性率高、部分胞内菌或厚壁微生物检出率低；在LRTI临床应用方面尚无统一标准，循证医学证据不足。由于这些问题的存在，当前mNGS可作为LRTI常规临床微生物检测技术的补充。本共识的重要意义在于，通过确定标准规范的样本采集、数据分析和临床解读流程，促进mNGS合理用于LRTI临床实践，同时指导开展临床研究获得一批高质量的循证医学证据，为下一版共识提供更多的依据。通过mNGS临床应用经验的不断积累，未来目标是使mNGS 检测流程标准化、检测方法同质化、数据解读生物信息库标准化，从而为感染性疾病的诊断提供更加专业的指导。
八、场景再现/真实案例（见文章开头）
2020年专家共识：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用
中枢神经系统感染性疾病的脑脊液宏基因组学第二代测序应用专家共识