单细胞分析发现肿瘤新型免疫检查点--CD161
标题：Inhibitory CD161 receptor identified in gliomainfiltrating T cells by single-cell analysis
期刊： Cell（IF=36.13）
导读
T细胞是癌症免疫治疗的关键效应因子，但其在弥漫性胶质瘤中的基因表达程序知之甚少。在这里，我们利用单细胞RNA测序(RNA-seq)绘制了31例 IDH野生型和IDH突变型胶质母细胞瘤患者肿瘤浸润T细胞的基因表达和克隆景观。我们在共同表达细胞毒性程序和几个自然杀伤(NK)细胞基因的T细胞亚群中发现了抗肿瘤免疫的潜在效应因子。对克隆扩增肿瘤浸润T细胞的分析进一步确定NK基因KLRB1(编码CD161)为候选抑制受体。因此，KLRB1基因失活或抗体介导的CD161阻断剂增强了T细胞介导的胶质瘤细胞体外杀伤和体内抗肿瘤功能。在其他人类癌症中，大量T细胞群体也表达KLRB1及其相关转录程序。本研究提供了神经胶质瘤中的T细胞图谱，并突出了CD161和其他NK细胞受体作为免疫治疗靶点。
实验设计
31例成年胶质瘤患者的新鲜肿瘤样本中分离出的浸润T细胞进行全长或者5’端单细胞RNA测序，并对其细胞类型、程序和状态进行了分析和描述。
实验思路
实验结果
⚫ 胶质瘤浸润T细胞群的单细胞图谱
对16例GBM和15例IDH-G患者的T细胞进行全场ScRNA-seq分析，识别出了四种主要的T细胞簇:CD8 T细胞、CD4常规T细胞(CD4 Tconv)、CD4调节性T细胞(Treg)和循环T细胞(图1C)。接下来通过基因的特异表达，进一步聚类将CD8和CD4细胞分别分为了6个亚群。其中，细胞毒性相关基因在6个CD8 T细胞簇之一中表达最高，同时NK细胞基因表达增加。
图 1
⚫ CD8 T细胞群体对NK细胞受体的表达
我们进行了进一步的分析，以确定T细胞状态的差异。首先，在GBM中CD8和CD4 T细胞群体中，反映T细胞毒性、干扰素和细胞应激程序的基因表达信号比IDH-G更强（图2A）。总的来说， GBM和IDH-G在浸润T细胞亚群中具有相似的组成，但GBM中T细胞的总丰度和细胞毒性程序较高。接下来，我们从全长scRNA-seq数据集对31例患者的每个T细胞进行了细胞毒性标记(PRF1, GZMB, GZMA, GZMH, NKG7和GNLY)和NK细胞标记(KLRD1, FGFBP2, FCGR3A, S1PR5, KLRC1, KLRC3, KLRB1和KLRC2) (STAR方法)。发现较高的细胞毒性标记评分与较高的NK细胞标记相关(图2C-2H)，关键细胞毒性基因(图2D)在NK标记评分高的CD8 T细胞中表达更高(图2D)。
图 2
⚫ 克隆T细胞群体中不同的基因表达程序
我们从scRNA-seq reads中重建了T细胞受体(TCR)序列，以识别可能在肿瘤抗原识别后增殖的克隆T细胞。克隆扩增T细胞的表达模式分析发现了四个主要的簇， GBM和IDH-G之间没有显著差异。在GBM中，与非克隆T细胞相比，克隆CD8 T细胞的细胞毒性基因(GZMB和NKG7)和NK受体(KLRB1和KLRD1)的表达更高(图3E)，支持这些程序可能识别肿瘤反应性T细胞。其中KLRB1编码CD161蛋白，该蛋白在与CLEC2D (LLT1)结合后可抑制NK细胞介导的细胞毒性。
图 3
⚫ T细胞CD161受体及其配体CLEC2D在恶性和髓系细胞中的表达
接下来对KLRB1基因进行进一步研究，通过流式细胞术和原位杂交证实了大部分GBM浸润的CD8 T细胞和大多数CD4 T细胞均为CD161阳性（4C）。RNA-ISH进一步证实KLRB1在CD3E+ T细胞群体中表达，CLEC2D mRNA主要在恶性细胞中表达，但也在CD45+免疫细胞中表达（4F）。
图 4
⚫ CD161作为肿瘤特异性T细胞的抑制受体
我们使用CD161抗体HP-3G10和人原代T细胞和病人来源的胶质瘤球（gliomasphere）共培养系统检测CD161-CLEC2D信号功能，发现靶向CD161途径增强了T细胞介导的细胞毒性，同时抑制型CD161受体的信号通路可能参与了PD-1的表达调控。我们制作了两种不同的小鼠模型来评估KLRB1基因对体内T细胞功能的影响。在神经胶质瘤的小鼠模型中，阻断CD161-CLEC2D通路强烈地增强了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力，并提高了实验小鼠的存活率。此外，阻断抑制通路似乎还可以减少T细胞衰竭——T细胞杀死细胞功能的丧失一直是免疫治疗的主要障碍。
图 5
接下来，我们使用来自黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝癌和结直肠癌的已发表的scRNA-seq数据集，研究了KLRB1是否可能与其他人类肿瘤中肿瘤浸润T细胞的类似转录程序相关。KLRB1在每一种癌症中由肿瘤浸润的CD4和CD8 T细胞亚群表达。与CD4 Tconv和CD8 T细胞相比，foxp3阳性Treg细胞的KLRB1表达较低，提示它可能主要抑制效应T细胞的功能，尽管KLRB1在黑色素瘤和弥漫性胶质瘤中都有表达，但与黑色素瘤浸润的CD8和CD4 T细胞相比，KLRB1是弥漫性胶质瘤中表达较高的前10个基因之一。
图 6
总之，KLRB1基因失活或抗体介导的CD161阻断剂增强了T细胞介导的胶质瘤细胞体外杀伤和体内抗肿瘤功能。在其他人类癌症中，大量T细胞群体也表达KLRB1及其相关转录程序, 这意味着CD161可能是一个十分有吸引力的、胶质瘤的免疫治疗新靶点。
参考文献：
Mathewson Nathan D,Ashenberg Orr,Tirosh Itay et al. Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis.[J] .Cell, 2021, 184: 1281-1298.e26.
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