文献解读|免疫I CRISPR技术结合sc-RNA-seq筛选有效的CAR-T靶点

shbio 伯豪生物 2022-08-30

题目：CRISPR Screening of CAR T Cells and Cancer Stem Cells Reveals Critical Dependencies for

Cell-Based Therapies

中文题目：CRISPR对CAR-T细胞和癌症干细胞的筛选显示了基于细胞的治疗的关键依赖

影响因子：39.3

嵌合抗原受体CAR-T细胞针对大B细胞淋巴瘤具有显著的治疗优势。为了靶向成神经胶质细胞瘤（Glioblastoma，GBM），CAR-T细胞已经被有针对性的改造，并在GBM患者中显示出一定的治疗活性。然而，CAR-T细胞治疗结果仍不乐观，仍需进一步的改造以提高CAR-T细胞靶向GBM的抗肿瘤效力。本研究中，作者对CAR-T细胞和患者来源的GSCs细胞进行了全基因组的CRISPR筛选，探索了CAR介导T细胞对GBM的杀伤分子决定因素，确定了效应分子TLE4和IKZF2。靶向敲除这些基因可增强了CAR的抗肿瘤疗效。完成上述研究后，作者对编辑后的CAR-T细胞进行高通量的单细胞RNA测序，结果显示T细胞功能耗竭占比降低。本研究还确定了CAR介导的杀伤敏感的基因：包括RELA和NPLOC4，敲除改变了肿瘤免疫信号，增加了CAR治疗的反应性。总的来说，CRISPR对CAR-T细胞和GSCs的筛选发现了提高CAR治疗GBM疗效的途径，并有可能扩展到其他实体肿瘤。用全基因组CRISPR/Cas9文库转导CART细胞，与GSC共培养，48小时后再刺激GSC。在筛选结束时（再刺激24小时后），对CART细胞进行PD-1阳性的分类，并分别对PD-1+或PD-1−CART细胞进行测序，以确定细胞图谱。

图1 整体研究概述

完成基因编辑，及前期的关键分子确定后，作者通过基因编辑敲除方式构建细胞系，并针对细胞系进行CAR的改造，最终对改造结果进行基于单细胞测序的检测分析。

TLE4-KO对CAR-T细胞亚群的影响

A图是整体的单细胞u-MAP聚类显示，B图是分组展示。E-H是对一些基因敲除后，作者关注的T细胞中可能决定CAR-T细胞功能基因的表达映射。

图2. TLE4-KO对CAR-T细胞亚群的影响

KZF2-KO对CAR-T细胞亚群的影响

A图是整体的单细胞u-MAP聚类显示，B图是分组展示。G-H是对一些基因敲除后，作者关注的T细胞中可能决定CAR-T细胞功能基因的表达映射。

图3. KZF2调控CAR-T细胞亚群

GSCs全基因组筛选鉴定了介导CART细胞抗性的基因，敲除RELA或NPLOC4可使GSCs对car介导的抗肿瘤活性敏感。

接下来，作者试图确认和进一步表征敲除促进CAR杀伤功能。选择V-Rel网状内皮病病毒癌基因同源物A(RELA)和核蛋白定位蛋白4同源蛋白A(NPLOC4)进行进一步验证，因为筛选中所有靶向这两个基因的sgRNAs在与CAR共培养的GSCs中均显示缺失。正如作者预期，与转导对照非靶向sgRNAs的GSCs相比，CRISPR介导的RELA或NPLOC4的KO导致体外sgCONT的CAR-T对GSCs的生长抑制程度有限。

图4.与CAR-T细胞共培养的GSCs中的CRISPR/Cas9筛选

图5.RELA或NPLOC4的敲除改善了CAR-T细胞对GSCs的杀伤

图6.GSCs和CAR-T细胞上的靶点的功能和临床相关性

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