从传统工艺到强化工艺：产量提升8倍，成本降低10倍

来自美国百事美施贵宝的研究人员在2020年底12期的《MABS》杂志上发表了题为“Biomanufacturing evolution from conventional to intensified processes for productivity improvement: a case study”的文章。文中，研究人员指出，工艺强化已经在提高生物生产产量以及降低成本方面显示出了极大的潜力，而在该文章中，其介绍了如何将使用CHO细胞生产mAb的生产工艺从1000 L规模的传统工艺方案(工艺A)转变为1000 L (工艺B)和2000 L 规模(工艺C)强化工艺方案。对于上游部分，方案通过富集N-1种子培养液（工艺B）或以灌流模式操作N-1步骤（工艺C），进行了强化种子培养方案，以提高生产生物反应器（N）前的种子培养步骤（N-1）的细胞密度。N-1步骤更高的最终细胞密度可显著提高以补料分批模式操作的生产生物反应器的接种密度，从而显著提高滴度，相比工艺A，工艺B增加了4倍，工艺C增加了8倍，同时可维持相当的最终产物质量。下游工艺也进行了多种改变，以强化工艺，适应更高的上游滴度。Protein A和阴离子交换层析步骤采用了新的高载量填料，而阳离子交换层析 (CEX)步骤从结合-洗脱模式更改为流穿模式。针对Protein A捕获开发了多柱层析方法，而整合式的AEX-CEX精制步骤可使工艺C实现半连续操作，提高产率的同时，降低了填料需求、缓冲液消耗和处理时间。针对耗材的产品成本分析显示，从传统工艺A转变为强化工艺C，成本降低了6.7 -10.1倍。文章介绍的混合-强化工艺很容易在生产中实现，同时，为开发完全连续的生产奠定了良好的基础，未来可能可获得更高的产量。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。

生物生产模式示意图：工艺A - 传统补料分批，1000 L规模，n=5；工艺B - 富集N-1种子培养液的强化补料分批，1000 L规模，n=8；工艺C - 结合灌流N-1的强化补料分批，2000 L规模，n=3。

简介

利用哺乳动物细胞培养的生物生产技术的发展已经使滴度从mg/L增加到了g/L，这使得在过去30年里，商品成本(COG)得以大幅降低。提高滴度的主要策略包括细胞系工程、培养基开发以及生物反应器参数的优化，而在工艺过程中，必须维持所需的、可接受的产品质量属性。然而，BioPlan Associates最近的调查表明，产率和产量的提升仍然是生物生产行业面临的最主要的挑战。为了降低生产成本，让更多的病人可以得到治疗，通过连续或半连续的生物生产来强化工艺的方法已经在学术界和工业界得到了广泛的研究。

工艺强化的定义是采用创新的技术和方法，来实现重大的工艺提升(如产量)，这将大大降低生产成本和设备占地。在化工领域，为了更高效地制造商业化产品，已经成功地实现了工艺强化，过去几十年里，成本和工厂面积大大降低。然而，在高度监管的生物生产行业中，实施连续或灌流操作更具挑战性，因为该行业使用活的生物体，以小得多的生产规模，生产更昂贵的生物制品。灌流细胞培养需要不断添加等量的新鲜培养基，并去除耗竭的培养基，同时利用灌流设备(如交替切向流(ATF)设备)将细胞截留在生物反应器中。据报道，在补料分批培养的基础上，使用灌流培养的CHO细胞可将不稳定酶的单位体积产量提高40倍。

另一方面，将灌流操作应用于N-1种子培养步骤，来强化补料分批生产工艺，在近年来取得了很大进展。与接种密度约为0.5×10^6 cells/mL的传统补料分批培养相比，在接种阶段，通过N-1灌流，可将接种密度提高至2-8x10^6 cells/mL。这种强化的生物生产平台可以在更短的细胞培养时间内，达到与传统工艺相似的最终滴度，从而显著提高设备产量。由于这种策略只需要对现有的生产设施进行最小程度的更改，N-1种子培养灌流强化已广泛应用于生物制药行业。而最近，又开发了灌流N-1结合重新设计的培养基，使接种密度达到10-20×10^6 cells/mL的强化补料分批平台，并被用于多种生物制品。这种补料分批策略可以达到目前文献中报道的最佳滴度的上限范围。

与上游工艺在补料分批滴度方面的提升相比，过去的几十年里，在商业化生产中，下游总体批次产量虽然也有所提高，但幅度较小，从大约35%提高到70%(尽管有报道称达到了80%)。mAb捕获的一个常见步骤是Protein A层析。由于填料制造技术的进步，Protein A的上样载量从<40 g/L_resin提高到70-80 g/L_resin。精制层析步骤已经从结合-洗脱演变为流穿模式，简化了操作，并显著提高了吞吐量。尽管如此，随着上游滴度的大幅增加，批次式下游操作仍然是生物工艺的主要瓶颈，并占到了整个生物生产成本的很大一部分。由于其有限的上样载量和高成本，Protein A填料是批次式下游操作时所面临的主要挑战，特别是当上游滴度超过约10 g/L时。

为了消除下游产能制约瓶颈，学术界和产业界都致力于通过实施连续层析和其它技术(如病毒连续灭活和过滤工艺)来强化下游工艺。特别是连续Protein A层析，即多柱层析(MCC)，相比批次捕获，其表现出了更高的产率以及更高的单次循环产物上样，显著降低了缓冲液消耗以及生产设施占地，同时可维持令人满意的实验室和中试规模产物产量和质量。此外，典型两柱步骤(如阳离子交换层析(CEX)、阴离子交换层析(AEX)、疏水作用层析)的整合精制操作，可消除中间储罐和中间池调整步骤，有效缩短处理时间。

在本案例研究中，我们比较了三种以CHO细胞生产mAb的生物生产工艺，以证实从传统批次工艺（即工艺A）转变为两种商化化生产可用的强化工艺（工艺B和工艺C）的可行性。一个可在生物生产中实施的、整合了上下游的混合工艺C包括了一些用于实现工艺强化的连续元素。在该工艺的上游部分开发了N-1灌流，显著提高了补料分批的滴度，与文献报道的最高滴度相当。为了显著提高下游产量，开发了两柱MCC Protein A捕获和整合精制步骤。此外，针对不同生产工艺，研究给出了最终药物物质的分析可比性以及耗材COG分析。

材料和方法

如上图所示的三种不同生物生产工艺在不同的GMP设施中用于同一mAb的生产。工艺A是最初用于临床I期试验药物底物生物生产的工艺。之后，为提高生产效率，工艺A被替换为工艺B，随后又被替换为工艺C。从工艺A到B再到C，使用了营养物不断增加的专利化学限定种子扩增、基础和补液培养基，以满足更高的接种密度的需求。

详细材料、方法及分析，请参考原文。此处介绍以工艺C为主。

工艺C采用与工艺A、B相同的CHO2 (GS-/-)细胞系，解冻后在B2基础培养基中扩增。细胞每3天传代一次，然后进行N-2种子接种。N-2灌流种子培养在50 L波浪式生物反应器中进行，工作体积为25 L，含B2基础培养基，接种密度为2.3 × 10^6 cells/mL。波浪式生物反应器配备过滤器，去除耗竭的培养基，同时截留细胞。灌流于第1天开始，通过蠕动泵以同样的速率不断添加新鲜的B2培养基，抽出耗竭的培养基，以实现培养基置换。灌流速率采用逐级控制模式，第1 - 3天为0.5 VVD，第3 - 4天为1 VVD。温度设置为36.5°C。振荡速度控制在28 rpm，振荡角度为7°。在第4天，适当控制空气和CO2气体流量以保证细胞生长良好，最终VCD为26-42×10^6 cells/mL，细胞活性>90%。N-1灌流种子培养在500 L一次性使用生物反应器中进行，工作体积为195 L，含B2培养基，接种密度为3.3×10^6 cells/mL。将一次性使用XCELL ATF® 6 系统连接到500 L生物反应器，以进行培养液灌流。以相同的速率连续添加新鲜的B2培养基并连续去除废弃的培养基。灌流速率在第1天开始为0.04 nL/cell/day，通过在线电容探针检测VCD以进行控制。温度维持在36.5°C、pH值设置为7.2，并根据需要，通过添加CO2或碳酸钠来控制。搅拌设置为100 rpm。顶部空气设置为2.9 LPM，底部空气设置为1.0 LPM。通过氧气级联控制维持溶氧为40%。以第6天最终VCD 90-120×10^6 cells/mL、细胞活性>90%为目标。以N-1灌流种子接种的强化补料分批生产(工艺C)在2000 L一次性使用生物反应器中进行，初始工作体积为1210 L，含B3基础培养基，接种密度为16×10^6 cells/mL。开始温度为36.5°C，从第3天开始温度降低至32.0°C。pH值设置为7.2，并根据需要，通过添加CO2或碳酸钠来控制。搅拌设置为90 rpm。顶部空气设置为13.3 LPM，底部空气设置为25 LPM。通过氧级联控制维持溶氧为40%。专利补液培养基F3从第2天开始补加，在余下的运行时间里每天补加。接种后第14天，通过深层过滤，最终收获约1800 L的细胞培养液。收获的原液经0.22μm过滤澄清。

对于下游工艺，工艺C有两个主要的变化：(1) 两根装填PR2填料、尺寸在13.8和15.7 L之间的层析柱以循环模式用于Protein A步骤，其可获得最高75 g / L_resin的载量，以处理大约2000 L的细胞培养收获液。这可显著降低填料的成本，且相比原工艺，可获得相似甚至略高的产率。(2)在精制步骤中，一根装填AR2的34 L层析柱连接一根以流穿模式运行的装填CR的58 L层析柱，从而使AEX的上样载量最高可达500 g / L_resin ，而CEX最高可达250 g / L_resin。这一整合式AEX-CEX步骤可按每批次单个循环的方式处理Protein A病毒灭活料液池，同时减少将近一半的处理时间，节省了人力以及设备占用时间。

结果与讨论

研究的详细结果分析，请参考原文。

本案例研究是首个在2000-L规模下成功实施用于mAb生产的混合、强化生物生产工艺(即工艺C)的报导。最终的生产工艺包括利用N-1灌流的的上游补料分批强化和以MCC Protein A 捕获及整合式AEX-CEX精制步骤进行的下游强化。工艺C获得了文献报导的补料分批最高可获得滴度，且相比原始工艺（工艺A），获得了更高的下游产量。除了常见的上游滴度提升策略（如细胞系工程、培养基开发、工艺参数优化等）外，通过富集N-1种子培养(工艺B)和N-1灌流(工艺C)来增加接种密度的方式都起到了关键作用。还应该注意，虽然相比工艺A和B，工艺C通过灌流工艺，在N-1步骤获得了约100×10^6 cells/mL的密度以及在补料分批生产阶段更高的峰VCD，在生产规模下，高细胞密度培养所需的氧气需求可以简单地在恒定搅拌条件下，通过级联控制鼓泡通入纯氧，同时维持恒定气体鼓泡以保证CO2脱气来满足。

N-1种子培养结果：使用工艺A、B和C进行mAb生物生产时的（a）VCD；（b）细胞活性和补料分批生产培养性能；（c）VCD；（d）细胞活性；（e）滴度；（f）细胞特异性产率。

对于工艺的下游部分，传统工艺A与优化工艺B之间的主要区别包括Protein A填料从PR1更换为PR2、AEX填料从AR1更换为AR2、CEX从结合/洗脱模式更换流穿模式。这些下游的变化使填料结合载量和吞吐量显著提高。此外，工艺C中的MCC Protein A步骤显著提高了捕获效率，降低了缓冲液消耗和填料体积，而整合式AEX-CEX操作有效地缩短了工艺时间，消除了批次式AEX和CEX步骤所需要的中间池和上样调整步骤。

以工艺A、B和C生产的最终药物底物批次的质量属性（电荷异构体、N-链糖基化、SEC杂质以及ELISA效价）。

尽管从工艺A到工艺B再到C，上游滴度和下游产量显著提升，以三种工艺生产的最终药物底物质量属性相当。大部分的质量属性更好或至少相同，三个工艺中有差异的小部分质量属性也在可接受范围内。有文献报道，通过提高VCD实现工艺强化而获得的高滴度工艺通常会导致更高的杂质含量，如HCP。在本研究中，我们证明了标准的下游三步层析，不管是批次(工艺A和B)或半连续方案(过程C)，都能达到令人满意的杂质去除的效果。此前针对连续层析清除病毒能力的研究表明，捕获的交替模式并不影响其除病毒能力。在这些工艺中，AEX步骤在物料上样方式上保持不变(即，直接从中间池，而不是直接从前步柱洗脱液)，因此它的除病毒能力不会有所不同。因此，可以可靠地控制强化补料分批生产工艺的质量属性。

假定工艺A、B和C均为2000 L生物反应器规模时的耗材（填料、过滤器、储袋、培养基、缓冲液和探针）成本比较：（a）上游和下游；30 kg（c）和300 kg（c）药物底物产出时的步骤成本；（d）细分成本

总结来说，本文的案例研究证实了一个补料分批工艺从传统方案向混合的强化工艺方案转变的可行性，后者在上游步骤中使用强化的种子培养策略，以显著提高滴度，而在下游，通过连续或半连续层析操作，显著提高了填料结合载量、产率以及吞吐量。强化工艺稳健，且可成功规模放大至临床生产，同时显著降低COG。不同工艺的工艺内和最终药物底物质量属性相当。

原文：J.Xu, X.Xu, C.Huang, et al., Biomanufacturing evolution from conventional to intensified processes for productivity improvement: a case study. MABS, 2020, 12 (1) : 1-13.

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